本期主体：天然药物化学 第十三章：项目

项目一：生物碱类化学成分的提取、分离与鉴定

学习目标：

了解黄连的来源及资源分布。·

熟悉盐酸小檗碱等主要成分的结构类型、特点及植物分布。

·掌握盐酸小檗碱等主要成分的理化性质。

【能力目标】

·依据盐酸小檗碱的理化性质,运用煎煮法、盐祈法和结晶法进行提取、分离纯化。

·能够运用薄层色谱法和化学法鉴定盐酸小檗碱。

·熟悉基本操作过程及注意事项。

一、黄连来源及主要化学成分性质

1.黄连来源

黄连为毛莨科植物黄连 Coptis chinensis Franch.,三角叶黄连 Coptis deltoidea C.Y.Cheng eHsiao 或云连 Coptis teeta Wall.的干燥根茎,主产于中国四川、云南等地区。

2.主要化学成分性质

黄连的有效成分主要是生物碱:小檗碱、巴马丁、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱和表小檗碱等。其中以小檗碱含量最高(大约10%)。小檗碱为异喹啉类原小檗碱型生物碱,具有明显的抗菌作用。

小檗碱又名黄连素,分子式[C20H18NO4]+,分子量为336.37。从水或稀乙醇中结晶所得的小檗碱为黄色针状结晶,含5.5分子结晶水,在100℃干燥后仍保留2.5分子结晶水,加热至110℃变为棕黄色.160℃分解。盐酸小檗碱为黄色小针状结品,在220℃左右分解,形成小檗红碱(红棕色),在285 ℃左右完全熔融。

小檗碱能缓慢溶于冷水(1:20),易溶于热水和热乙醇,难溶于丙酮、氯仿和苯等。小檗碱和酸结合成盐,其盐类在水中的溶解度见表13-1。

小檗碱与大分子有机酸结合成的盐在水中的溶解度很小,当黄连与甘草、大黄和黄芩等配伍时,能和甘草酸、大黄鞣质,黄芩苷形成难溶于水的化合物而沉淀析出,这是在中药制剂过程中需要注意的问题。

小檗碱通常以季铵型状态存在,能溶于水,水溶液呈强碱性(pKa=11.50),溶液为红棕色。如果在水溶液中加人过量的碱.可抑制季铵离子的解离,使其部分转变为醛式或醇式,溶液也变成了棕色或黄色。醇式或醛式小檗碱具有亲脂性.可溶于亲脂性有机溶剂。小碱的三种互变异构体如下。

二、实验原理

小檗碱的提取是利用小檗碱盐的溶解性,通过用稀硫酸提取小檗碱硫酸盐,再用浓盐酸把小檗碱硫酸盐转化为小檗碱盐酸盐,再结合盐析法使结晶析出。并且利用小碱在冷,热水中的溶解性差异大,用水重结晶进行精制。

三、实验材料

(一)实验试剂

黄连粗粉、0.3%H,SO,溶液、石灰乳、盐酸、蒸馏水、浓硝酸、氢氧化钠、丙酮、碘化汞钾、碘化铋钾 、硅钨酸、甲醇-丙酮-乙酸(4:5:1)溶液、氣化钠、乙醇等。

(二)实验仪器设备

圆底烧瓶、电热套、纱布、棉花、烧杯、玻璃棒、硅胶板等。四、实验方法1.提取黄连中盐酸小檗碱的提取流程见图13-1。

盐酸小檗碱溶液过滤,抽干,用少许蒸馏水洗涤,70℃以下干燥,得小檗碱精品。称量,计算提取率。

3.鉴定

1)显色反应

(1)浓硝酸、漂白粉实验:取盐酸小檗碱少许,加稀硫酸8ml溶解,置于2支试管中.1支加2滴浓硝酸,显樱红色;另1支加少许漂白粉,也显樱红色。

(2)丙酮小檗碱实验:取盐酸小檗碱少许.加5ml蒸馏水,水浴加热溶解.加人氢氧化钠试液2滴,显橙色,放冷,加丙酮4滴,出现黄色丙酮小檗碱结晶。

(3)生物碱沉淀反应:取盐酸小檗碱少许,加稀硫酸12ml溶解,置于3支试管中,分别加人碘化汞钾试剂、碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂,观察其产生的现象。

2)薄层色谱鉴定

(1)制板:取色谱用硅胶8g:加人0.3%~0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20~25 m.用研钵制成稀糨糊状,然后均匀倒在两块清洁的玻璃板上,铺成一均匀薄层,室温晾干,105℃活化30 min备用。

(2)点样:取自制盐酸小檗碱少许,加人1ml乙醇溶液溶解和盐酸小檗碱乙醇对照品溶液。

(3)展开剂:甲醇-丙酮-乙酸(4+5:1)溶液。

(4)展开方式:预饱和后,上行展开。

(5)显色:先观察荧光斑点,再喷改良碘化铋钾试剂显色。

(6)观察记录:记录图谱及斑点颜色。

五、实验说明及注意事项

(1)提取时稀硫酸浓度应控制在0.2%~0.3%,使黄连中的小檗碱全部转化成硫酸盐而溶解。如果硫酸浓度过高,小檗碱会转化为硫酸氢盐,从而降低溶解度,影响提取效率。

(2)用石灰乳调节pH,可以使硫酸小檗碱游离成小檗碱.并可使果胶、黏液质等多糖杂质沉淀。

(3)加氯化钠的目的是利用盐析作用,降低盐酸小檗碱在水中的溶解度,其浓度不超过10%,否则会造成细小的盐酸小檗碱结晶呈悬浮状而给过滤造成困难。盐析用的氯化钠尽可能选用杂质较少、纯度高的氯化钠。

(4)在精制盐酸小檗碱时,因盐酸小檗碱几乎不溶于冷水,放冷易析出结品,所以水浴加热溶解后,要趁热过滤,防止盐酸小檗碱在过滤时析出结晶,使过滤困难,产量降低。

六、思考题

(1)根据小檗碱的性质,除用硫酸溶液提取外,还可用哪些提取方法?请简要说明

(2)在本实验色谱条件下,计算小檗碱的R值。

(3)查阅文献:黄连中总生物碱含量的测定。

任务2 苦参中苦参碱的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】

·了解苦参的来源及资源分布。

·熟悉苦参碱的结构类型、特点及植物分布。

·掌握苦参碱的理化性质。

【能力目标】·通过苦参生物碱的提取掌握用渗滤法和离子交换色谱法提取生物碱的方法。

·掌握索氏提取器的使用方法。·熟悉基本操作过程及注意事项。

一、苦参来源及主要化学成分性质

1.苦参来源

中药苦参是豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait)的干燥根,主产于中国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地区。

2.主要化学成分性质

苦参中主要含苦参碱、氧化苦参碱、脱氢苦参碱、槐定等,苦参碱结构如下。

苦参碱,分子式为CH,NO,分子量为248.37,在轻石油醚中结晶时,由于温度等条件不同,可以得到α、B、8三种结品(熔点分别为76℃、87℃、84℃)和一种流体即y型。通常室温下结晶得到的是α型,其易溶于水、甲醇、乙醇、氣仿,溶于苯,在乙醚中溶解度小。

二、实验原理

苦参碱为喹诺里西定类生物碱,利用叔胺氨化合物与酸成盐溶于水的特性与非生物碱分开,提取的生物碱盐的阳离子部分与日型树脂发生交换,生物碱吸附在柱上,吸附有生物碱的树脂,碱化呈游离生物碱,可被氯仿等有机溶剂提取。

三、实验材料

(一)实验试剂

苦参粗粉、盐酸、色谱用氧化铝、磺酸H型聚苯乙烯离子交换树脂(交联度8%)浓氨水、氯仿、丙酮、甲醇、乙醚、氢氧化钠、碘-碘化钾试剂、碘化汞钾试剂、碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂等。

(二)实验仪器设备渗漉筒、色谱柱、烧杯、布氏漏斗、医用搪瓷盘、恒温水浴箱、色谱槽、索氏提取器、研钵等。

四、实验方法

1.提取

苦参中提取总苦参碱的工艺流程见图13-3。

2.分离

(1)柱色谱法:取100目色谱用氧化铝50g,用漏斗缓慢加入色谱柱内(1cmx24cm,干法装柱)取苦参0.2g.加入适量氧化铝,搅匀,研细,装入色谱柱顶端,先用50mL,氯仿通过色谱柱,再用氯仿甲醇(9:1)洗脱,流速为1mL/min。每10ml为一份(约收集15份),经薄层色谱鉴定,相同流出成分合并,在水浴上挥发溶剂,剩余物加无水丙酮溶解,放置,析出结晶为氧化苦参碱。

(2)溶解度差异法:将苦参总碱溶于少量氣仿中,加入10倍量乙醚,放置后有沉淀析出,过滤析出的沉淀,滤液浓缩后再溶于少量氣仿中,加入乙醚放置,再过滤析出的沉淀,合并两次沉淀物,用丙酮重结晶,即为氧化苦参碱。

3.鉴定

(1)生物碱沉淀反应:取苦参碱的酸水液置于3支小试管中,每份1ml,分别滴加碘化铋钾试剂碘-碘化钾试剂和硅钨酸试剂2~3滴,观察有无沉淀产生及颜色变化。

(2)薄层色谱鉴定。

①制板:取色谱用硅胶8g,加人0.3%~0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20~25 mL,用研钵制成稀糨糊状,然后均匀倒在两块清洁的玻璃板上,铺成一均匀薄层,室温晾干,105℃活化30min备用。

②点样:苦参总碱、氧化苦参碱、苦参碱标准品、氧化苦参碱标准品。

③展开剂:氯仿-甲醇-浓氨水(5:0.6:0.2)。

④展开方式:预饱和后,上行展开。

⑤显色:先观察荧光斑点,再喷改良碘化铋钾试剂显色。

⑥观察记录:记录图谱及斑点颜色。

五、实验说明及注意事项

(1)浓盐酸、氨水均具有刺激性,使用时注意通风。

(2)丙酮、氯仿、甲醇、无水乙醇和乙醚均为易燃品,注意防火安全。

(3)在将药材装柱时,不要将药材塞得过紧或过松。过紧,则渗漉速度太慢;过松,则渗漉速度太快,达不到渗漉效果。

六、思考题

(1)实验现象记录。

(2)在收集渗漉液的过程中,溶液的颜色有何变化?在回流提取中,有何现象发生?(3)薄层色谱的结果如何?

任务 3-叶萩中一叶萩碱的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】

了解一叶萩的来源及资源分布。

·熟悉渗漉、连续回流提取法的基本原理和操作;薄层色谱法的基本制作方法;生物碱的化学鉴别反应。

·掌握酸-碱分离生物碱的基本原理;离子交换色谱法分离的基本原理和操作。

【能力目标】

·依据一叶萩碱的理化性质,运用渗漉法、连续回流提取法进行提取，利用离子交换色谱法进行分离纯化。

·能够运用薄层色谱法和化学法鉴定一叶萩碱。

·熟悉基本操作过程及注意事项。

一、一叶萩的来源及主要化学成分性质

1.一叶萩的来源

一叶萩也称叶底珠,为大戟科植物叶底珠(Securinegasuffruticosa(Pal.)Rehd.)的叶及花。除西北尚未发现外,全国各省区均有分布,生于山坡灌丛中或山沟、路边,海拔800~2500m。蒙古、俄罗斯、日本、朝鲜等也有分布。

2.主要化学成分性质

一叶萩中主要含有一叶萩碱、二氢一叶萩碱、别一叶萩碱等,其中以一叶萩碱含量最高,其结构

如下

一叶萩碱又称叶底珠碱。分子式为CHNO:,分子量为217.26。黄色针品(乙醇).熔点为142~143℃,易溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,较难溶于石油醚,难溶于冷水,不于稀碱液。

二、实验原理

叶萩碱为叔胺碱，pK,约为7,2,具有生物喊的，一般通性，本实验利用生物碱些易溶于水,游离生物碱易溶于有机溶剂的性质,将原料用酸水提取,提取液通过阳离子交换树脂,使生物碱被树脂吸附,随后碱化树脂使生物碱游离,用石油醚进行提取,回收溶剂即可得生物碱。一叶萩碱的鉴别则利用薄层色谱法等进行。

阳离子交换色谱法纯化生物碱的原理如下。

酸化:A1K+H+→A1KH(A1K为生物碱)

交换:RSO3-H++AIKH+→RSO3-AIKH++H+

碱化:RSOAIKH++NH4+OH-→RSO3-NH++AIK+H2O

三、实验材料

(一)实验试剂

一叶萩、磺酸氢型聚苯乙烯离子交换树脂(交联度 8%)、硫酸、盐酸、石油醚等。

(二)实验仪器

设备渗漉筒、色谱柱、烧杯、布氏漏斗、医用搪瓷盘、恒温水浴箱、色谱槽、索氏提取器、研钵等

四、实验方法

(一)提取与分离

1.树脂的预处理

取新树脂,用蒸馏水溶胀,置于烧杯中,用5倍量的6%~7%的盐酸浸泡过夜,先用离子水洗净至pH3~4,改用蒸馏水洗至中性.再用5%NaOH溶液(约2倍)搅拌洗涤后,水洗至中性,最后用6%~7%HC1溶液转型,蒸馏水洗至中性。

2.渗漉法提取

取渗漉筒,在其底部放一块脱脂棉(先用水润湿),依次加人润湿过的药粉,分层填压.顶部盖一层滤纸,压一块洁净的鹅卵石,用3%的H,SO 溶液1000 mL,以6~8mL/min的速度进行渗漉,渗漉液直接进入阳离子交换树脂柱。

3.离子交换色谱法纯化

(1)吸附:一叶萩的酸水提取液通过阳离子交换树脂柱(约50g阳离子交换树脂,动态装柱),以6~8L/min的速度进行交换,测定交换液的pH,画出时间-pH 曲线图。

(2)碱化:酸水液全部交换完毕后,将树脂倾入烧杯中,水洗至澄明,抽干,放置于培养皿中,室温风干。然后·将树脂用氨水10~12m碱化,放置20min后挥散多余氨。

(3)提取:将树脂装人滤纸筒,置于索氏提取器中,用石油醚(30~60℃)120mL,水浴回流提取3h,取出树脂筒,提取液回收至体积20ml,左右后转移至干燥的小锥形瓶中,加盖放置,析出结晶后抽滤。

一叶萩中一叶萩碱的提取流程如图13-4所示。

(二)鉴定

1.生物碱沉淀反应

取渗漉液1mL,分别加碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂和硅钨酸试剂2~3滴,观察有无沉淀产生及颜色变化。

2.薄层色谱鉴定

(1)吸附剂:A1O(中性)。

(2)点样:一叶萩碱的氯仿溶液和标准品一叶萩碱的氯仿溶液。

(3)展开剂:氣仿、氣仿-石油醚(1:1)溶液、氣仿-乙醇(9:1)溶液。

(4)展开方式:预饱和后,上行展开

(5)显色:先观察荧光斑点,再喷改良碘化铋钾试剂显色。

观察记录：记录图谱及斑点颜色。

五、实验说明及注意事项

(1)装树脂时用蒸馏水将已处理好的树脂悬浮起来,加到底部垫有脱脂棉的交换柱中,待树脂颗粒下沉后,其上覆盖一层棉花或一张滤纸,以免加人液体时冲散树脂表面;另外,在整个操作过程中树脂柱的上部要留有少量液体,以免进入空气,影响交换效果。

(2)在酸水渗漉提取和离子交换树脂吸附过程中,一定要注意控制流速,避免流速过快影响提取和交换效率

六、思考题

(1)离子交换色谱法提取、分离一叶萩碱的原理是什么?

(2)离子交换色谱法提取纯化生物碱的程序及应该注意哪些问题?

(3)用氨水碱化树脂的目的是什么?

任务4 茶叶中咖啡因的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】·了解茶叶中的主要成分。

·熟悉升华的基本操作方法。

·掌握索氏提取器的原理和方法。

【能力目标】

·依据咖啡因的理化性质，运用索氏提取器通过提取、升华法进行纯化。

·能够运用薄层色谱法和化学法鉴定粉防已碱。

·熟悉基本操作过程及注意事项。

一、茶叶的主要化学成分及其性质

茶叶中含有多种生物碱,其中以咖啡因为主,占1%~5%。另外还含有11%~12%的单宁酸(又名鞣酸)、0.6%的色素、纤维素、蛋白质等。咖啡因是弱碱性化合物,易溶于氣仿(12.5%)、水(2%)及乙醇(2%)等;在苯中的溶解度为1%(热苯为5%)。单宁酸易溶于水和乙醇,但不溶于苯。咖啡因是杂环类化合物嘌呤的衍生物,它的化学名称为1.3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤,其结构式如下:

咖啡因是白色针状结晶,无臭,味苦。易溶于水、乙醇、丙酮、氣仿,微溶于石油醚,难溶于乙醚和苯。100℃时失去结晶水,并开始升华,178℃时升华很快。咖啡因的熔点为238℃。

二、实验原理

本实验从茶叶中提取咖啡因是用适当的溶剂(95%乙醇),在索氏提取器中连续抽提,然后浓缩、焙炒而得粗制咖啡因,最后通过升华提纯得到纯咖啡因产品。

升华法是纯化固体有机物的方法之一。某些物质在固态时有较高的蒸气压,当加热时不经过液态而直接汽化,这个过程叫作升华。升华得到的产品有较高的纯度,这种方法特别适用于纯化易潮解或易与溶剂起反应的物质。

升华法只能用于纯化在不太高的温度下,有足够的蒸气压(在熔点以下高于266.6Pa)的固态物质，因此有一定的局限性。

三、实验材料

(一)实验试剂

茶叶、氯仿、生石灰粉、钨硅酸试剂,碘化铋钾试剂、氣仿-甲醇(9:1)溶液等

(二)实验仪器设备

索氏提取器、滤纸、蒸发皿、烧杯、瓷坩埚等。四、实验方法

(一)提取和纯化

茶叶中咖啡因的提取和纯化流程如图13-5所示。

先将滤纸做成与提取器大小相适应的套袋。称取10g茶叶,略加粉碎,装入纸袋中,上下端封好，装入索氏提取器(图13-6)中,烧瓶中加人 60 mL,氯仿、几粒沸石,水浴加热,连续提取8~10次(提取时,溶剂蒸气从导气管上升到冷凝管中,被冷凝成液体后,滴人提取器中,萃取出茶叶中的可溶物,此时溶液呈深草青色,当液面上升到与虹吸管一样高时,提取液就从虹吸管流人烧瓶中.这为一次虹吸)。茶叶每次都能被纯粹的溶剂所萃取,使茶叶中的可溶物质富集于烧瓶中。待提取器中的溶剂基本为无色或微呈青绿色时(一般8~10次),可以停止提取,但必须待提取器中的提取液刚刚虹吸下去后,方可停止加热。

稍冷,改成蒸馏装置,水浴加热,回收大部分溶剂,待剩下3~5mL后,停止蒸馏,趁热将残液转人瓷蒸发皿中。在通风柜中,用蒸汽浴蒸出残液(图13-7),不必蒸得太干,拌人1~2g生石灰粉,用玻璃棒研细,在上覆盖面盖一个事先刺了许多小孔的滤纸和一个倒扣的玻璃漏斗,漏斗口用棉花塞住,将蒸发皿在石棉网上小火徐徐加热,进行升华(图13-8)。通常需要10~15 min.停止加热,让其自然冷却至不太烫手时,小心取下漏斗和滤纸,会看到在滤纸上附有大量无色针状晶体。纯粹的咖啡因熔点为234.5℃。

本实验分离需4~6h。

(二)检识

1.生物碱沉淀反应

(1)与钨硅酸试剂的反应:1ml咖啡因的乙醇溶液加1~2滴钨硅酸试剂,生成浅黄色或灰白色沉淀。

(2)与碘化铋钾试剂的反应:1ml咖啡因的乙醇溶液,加入1~2滴碘化铋钾试剂.生成浅黄色或

红棕色沉淀。

2.薄层色谱鉴定

(1)点样:用氯仿溶解质量相近的咖啡因粗制品和纯化产物、标准品咖啡因的氯仿溶液。

(2)展开剂:氯仿-甲醇(9:1)溶液。

(3)展开方式:预饱和后,上行展开。

(4)显色:先观察荧光斑点,再喷改良碘化铋钾试剂显色。

(5)观察记录:记录图谱及斑点颜色。

五、实验说明及注意事项

(1)本实验既可选用氯仿也可选用乙醇作萃取剂。但由于咖啡因在氣仿中溶解度大,需要较少的次数就可提取完全;且氯仿沸点低,挥发快,虹吸一次需要的时间也短。因此,为了节省时间.本实验选用氯仿作萃取剂。但是,氯仿对人有一定的毒性和麻醉作用,使用时蒸气尽量不要外露,尤其是蒸残留溶剂时,最好在通风柜中进行。

(2)实验中用滤纸制作茶叶袋也很讲究。其高度不要超过虹吸管,否则提取时,高出虹吸管的部分不能浸在溶剂中,提取效果就不好。纸袋的粗细应和提取器内筒大小相适应,太细,在提取时会漂起来;太粗,会装不进去.即使强行装进去,由于装得太紧,溶剂不好渗透,提取效果不好,甚至不能虹吸。另砖到已笱歲諍瘐祆腆昭王,茶嗥括叶袋的上下端也要包严,防止茶叶末漏出·堵塞虹吸管。

(3)本实验的关键是升华过程,一定要小火加热,慢慢升温,最好是酒精灯的火焰尖刚好接触石棉网,徐徐加热 10~15 min。如果火焰太大,加热太快,滤纸和咖啡因都会炭化变黑;如果火焰太小,升温太慢,会浪费时间,部分咖啡因没有升华,影响收率。

六、思考题

(1)本实验为何采用升华法提纯而不用重结晶法提纯?

(2)索氏提取器的原理是什么?

(3)蒸馏浓缩提取液时应注意什么?

(4)本实验中使用生石灰的作用有哪些?

(5)升华操作如何影响实验的成败?

项目二蒽醌类化学成分的提取、分离与鉴定

学习目标

任务1 大黄中蔥醌类成分的提取、分离与鉴定

【知识目标】。了解大黄的来源及资源分布。

·熟悉大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等主要成分的结构类型、特点及植物分布。

·掌握蒽醌类成分主要的理化性质。

【能力目标】

·能根据溶解性采用溶剂法从大黄中提取蒽醌类成分。

·能根据酸性的差异采用 pH 梯度萃取法分离各种蔥醌成分。

·能运用液液萃取法分离大黄中的各种蒽醌成分。

·能利用显色反应、薄层色谱鉴别葱醌类成分。

·能熟练进行回流、常压蒸馏、抽滤、色谱等操作。

一、概述

大黄记载于《神农本草经》等许多文献中,用于泻下、健胃、清热、解毒等。自古以来,大黄在植物性泻下药中占有重要位置,是一种很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多,优质大黄是蓼科植物掌叶大黄(Rheumpalmatum1..),药用大黄(Rheuofficinale Baill.)及唐古特大黄(Rheumntanguicum Maxim.exBalf.)的根茎及根,大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌类主要有五种(表13-2)。

大黄中蒽醌苷元的结构不同,因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH,酸性最强;大黄素连有 β-OH,酸性第二;芦荟大黄素连有苄醇-OH,酸性第三;大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基,前者连有一OCH和一CH;,后者只连有一CH,因而后者酸性排在第四位。

二、实验原理

大黄中含有大黄素型游离蒽醒及其苷类,本实验利用苷在酸溶液中发生水解形成苷元后溶于有机溶剂的性质,使用氯仿进行游离葸醌的提取,再利用各羟基总醌类化合物酸性不同,采用pH梯度萃取法进行游离蒽醌的分离。

三、实验材料(一)实验试剂

大黄粗粉、氣仿、浓硫酸、浓盐酸、冰乙酸,苯、乙酸乙酯、5%NaCO:溶液、5%NaHCO 溶液、5% NaOH 溶液、氢氧化钾、乙酸镁试剂等。

(二)实验仪器设备

500 ml,圆底烧瓶、冷凝回流管、分液漏斗、烧杯、量筒、常压漏斗(5~10cm 斗径)、定性滤纸、毛细管点样器、玻璃喷瓶、广谱 pH 试纸、纱布、多孔水浴锅、旋转蒸发仪等。

四、实验方法

(一)总蒽醌苷元的提取

大黄中总蒽醌元的提取流程见图13-9。

注意:①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合,以蔥醒的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿,苯及乙醚等有机溶剂,用苯时应注意苯蒸气的挥发,严防中毒;②所得的氯仿液中如带有酸水液,应该用分液漏斗分出弃去,并用蒸馏水回洗一次除去酸性成分以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出,可滤取之,该沉淀多为大黄素,余液供下一步分离实验用。

(二)总蒽醌苷元的分离与精制

1、大黄酸的分离与精制

将含有总游离蒽醌的氯仿液250mL移至1000ml,的大分液漏斗中,加pH8的5%NaHCO,溶液125ml振摇萃取(3次,每次125ml,至碱液无色),静置至彻底分层,放出氯仿液后,倒出碱水液至 500 ml,烧杯中,加盐酸酸化至 pH为3,待黄色沉淀析出完全后,过滤、干燥,干燥后的样品加冰乙酸10mL加热使溶解,趁热过滤,滤液静置,析出的黄色针品为大黄酸,过滤即得纯品。

2.大黄素的分离与精制

将被提取过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中.用pH9.9的5%NaCO 溶液125ml,振摇萃取(3次,每次125mL,至碱液无色),275mL振摇萃取,彻底分层后,分出碱液层,并用HCI酸化至pH 为 3.析出棕黄色沉淀,过滤,沉淀经干燥后,用10 ml 冰乙酸加热使其溶解,趁热过滤,析出橙色大针晶,过滤后,即得大黄素纯品3.芦荟大黄素的分离和精制余下氯仿液移至分液漏斗后,加5%NaCO,:5%NaOH(9:1)碱液125ml或用0.5%NaOH溶液125 m 振摇萃取,碱液加 HC酸化,析出的沉淀过滤干燥,用10 mL乙酸乙酯重结品,得黄色针晶状的芦荟大黄素纯品。

(三)鉴定

(1)化学鉴定:分别取总蒽醌提取物少许,用乙醚溶解,做如下反应。

①碱液实验:取试液1mL,加20%NaOH溶液数滴,观察颜色。

②乙酸镁反应:取试样1mL,加乙酸镁试剂数滴.观察现象。

(2)薄层色谱鉴定。

①吸附剂:硅胶-CMC。

②展开剂:CH-EtOAc(3:2或97:9)。

③显色剂:a.氨蒸气熏。b.5%KOH 溶液喷雾。

五、实验说明及注意事项

(1)pH梯度萃取法的原理及注意事项。

(2)设计萃取分离方案的程序与方法。

(3)分离萃取时一定要注意乳化层的分出,不要混人,并且每步最好用新鲜氣仿,回洗碱液。

(4)缓冲液的配制和碱液的配制要准确,严格注意检查。

六、思考题

(1)在实验过程中采用PH梯度萃取法分离游离蒽醒,萃取过程中若出现乳化现象,应如何处理?

(2)大黄酚和大黄素甲醚结构相似.怎样分离?

任务2 虎杖中蒽醌类成分的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】

·了解虎杖的来源及资源分布

·熟悉大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等主要成分的结构类型、特点及植物分布。

·掌握葸醌类成分主要的理化性质。

能力目标】

·能根据溶解性采用溶剂法从虎杖中提取蒽醌类成分。

·能根据酸性的差异采用 DH 梯度萃取法分离各种蔥醌类成分。

·能利用显色反应、薄层色谱鉴别葸醌类成分。

·能熟练进行回流、常压蒸馏、抽滤、色谱等操作。

一、虎杖来源及主要化学成分性质

1.药材来源及功效

虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatumsieb.etZucc.)的根及根茎,别名阴阳莲、花斑竹;味苦、性微寒;能清热解毒、袪风利湿、利尿通淋、祛痰、止咳、通经等,主要用来治疗湿热黄疸、风湿痹痛、烧伤烫伤、慢性气管炎等多种炎症。

2.主要化学成分类型

虎杖主要含大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等游离蔥醌类,以及少量的大黄素-6-甲醚-8-O-D-葡萄糖苷、大黄素-8-〇-D-葡萄糖苷等葸醌苷类。此外,还含非蔥醌类成分,主要是白藜芦醇葡萄糖苷(又称虎杖苷、云杉新苷),还有p-谷甾醇、鞣质等成分。

3.主要化学成分的结构

二、实验原理

本实验根据虎杖中的羟坐蔥配类化合物及笨乙类成分均叫溶于乙,采用乙醇将它们提收山来。羟基蒽醌类苷元成分能溶于乙醚等弱亲脂性溶剂,采用乙醚使苷元和苷类成分分离,又利用羟基蒽醌类化合物的酸性强弱不同,用pH梯度萃取法进行分离。

三、实验材料

(一)实验试剂

虎杖药材粗粉、95%乙醇、乙醚、5%碳酸钠溶液、5%氢氧化钠溶液、盐酸、10%氢氧化钠溶液、0.5%乙酸镁溶液等。

(二)实验仪器

设备500mL圆底烧瓶、冷凝回流管、分液漏斗、烧杯、量筒、滤纸、广谱pH试纸、纱布、抽滤装置、旋转蒸发仪等。

四、实验方法

(一)蒽醌类化合物的提取与分离蒽醒类化合物的提取与分离见图13-10

(二)蒽醌类化合物的鉴定

1.显色反应将上述分离得到的①②各少许,加1ml乙醇溶解,分别做下列实验,观察颜色变化并记录(1)碱液实验:加数滴10%氢氧化钠溶液,观察颜色变化,羟基蒽醌应显红色。

(2)乙酸镁实验:滴加0.5%乙酸镁乙醇溶液,观察颜色变化,羟基蒽醌应显橙红色

2.薄层色谱鉴定

(1)样品:上述分离得到的①各少许,分别加少量乙醚溶解,制成样品溶液。

(2)对照品:大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的乙醚溶液。

(3)薄层板:硅胶-CMC-Na板。

(4)展开剂:石油醚:乙酸乙酷(8:2)。

(5)显色剂:在可见光下观察,记录黄色斑点的位置,然后用浓氨水熏.斑点显红色。

五、实验说明及注意事项

(1)加碱液与乙醚萃取时,要注意防止乳化,否则,不能将成分分离。

(2)本实验多次使用乙醚,因此要特别注意防火安全,绝对禁止在有明火的情况下使用乙醚。(3)pH梯度萃取法分离时,乙醚液中可先用5%NaHCO3溶液进行萃取,则在NaHCO3溶液中可得到强酸性的成分

(4)大黄酚和大黄素甲醚二者相互分离比较困难,在上述薄层色谱条件下几乎同一位置出现斑点。进一步分离可用磷酸氢钙进行柱色谱,以石油醚洗脱.先被洗脱下来的黄色带,以甲醇重结晶可得大黄酚。后被洗脱下来的黄色带以甲醇重结品可得到大黄素6-甲醚。

六、思考题

(1)羟基蒽醌类成分具有哪些性质?根据它的性质,说明提取与分离的原理。

(2)大黄素的碱液反应和乙酸镁反应的原理是什么?

项目三 香豆素类化学成分的提取、分离与鉴定任务

秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】

·掌握从秦皮中提取与分离香豆素类化合物的原理和蒸馏、萃取等操作技术。

·掌握溶剂提取法、薄层色谱法的操作技术。

·熟悉香豆素类化合物的性质和检识方法。

【能力目标】

·能读懂操作规程并进行规范操作。

·能根据任务操作指令完成工作任务。

一、概述

秦皮为本犀科白蜡树属植物白蜡树(FraxinuschinensisRoxb.)或苦枥白蜡树或小叶白蜡树的树皮·味苦,性微寒;具有清热、燥湿、收涩作用;主治温热痢疾、目赤肿瘤等症。

秦皮中含有多种内酯类成分及皂苷、鞣质等,其中主要有七叶苷、七叶内酯、秦皮苷及秦皮素等,多有抗菌消炎的生物活性。七叶内酯对细菌性痢疾、急性肠炎有较好的治疗效果.兼有退热作用,毒副作用小,几乎无苦味,适合小儿服用。秦皮中主要成分的结构及性质如下。

(1)七叶苷(esculin):又叫马栗树皮苷:白色粉末状结晶,熔点为205~206℃。易溶于热水(15),可溶于乙醇(1∶24),微溶于冷水(1:610),难溶于乙酸乙酯,不溶于乙醚、氣仿。在稀酸中可水解。水溶液中有蓝色荧光。

(2)七叶内酯(esculetin):黄色针状结晶,熔点为276℃,易溶于沸乙醇及氢氧化钠溶液,可溶于乙酸乙酯,稍溶于沸水,几乎不溶于乙醚、氣仿。

(3)秦皮苷(fraxin):熔点为205℃。

(4)秦皮素(fraxetin):熔点为227~228℃。

二、实验原理

七叶苷、七叶内酯均能溶于沸乙醇,可用沸乙醇将二者提取出来,再利用二者在乙酸乙酯中的溶解性不同而分离。

三、实验材料

(一)实验试剂

秦皮粗粉、乙醇、氣仿、乙酸乙酯、无水硫酸钠、甲醇、1% FeCl 溶液、浓氨水、硅胶 G、甲酸乙酯、甲苯、七叶苷和七叶内酯对照品、重氮化对硝基苯胺等。

(二)实验仪器

设备索氏提取器、RE-52旋转蒸发仪、循环水式多用真空泵、分液漏斗(250mL)、电热恒温水浴锅、玻璃仪器气流烘干器、圆底烧瓶(1000 mL)、ZF-2型三用紫外仪、电热恒温干燥箱、移液管(10 mL、5mL)等。

四、实验方法

(一)提取

取秦皮粗粉150g于索氏提取器中,加400mL乙醇回流10~12h,得乙醇提取液,减压回收溶剂至浸膏状,即得总提取物。

(二)分离

在上述浸膏中加40ml水加热溶解,移于分液漏斗中,以等体积氯仿萃取2次,将氯仿萃取过的水层蒸去残留氯仿后加等体积乙酸乙酯萃取2次,合并乙酸乙酯液,以无水硫酸钠脱水,减压回收溶剂至干、残留物溶于温热甲醇中,浓缩至适量,放置析晶,即有黄色针状结晶析出。滤出结晶。用甲醇、水反复重结晶,即得七叶内酯。将乙酸乙酯萃取过的水层浓缩至适量,放置析晶,即有微黄色晶体析出。滤出结晶,以甲醇、水反复重结晶,即得七叶苷。

(三)鉴定

1.化学检识

取七叶苷、七叶内酯各少许分别置于试管中,加乙醇1mL溶解。加1% FeCl 溶液2~3滴,显暗绿色,再滴加浓氨水3滴,加水6mL,日光下观察显深红色。

2.薄层色谱鉴定

(1)吸附剂:硅胶 G。

(2)样品:七叶苷、七叶内酯标准品及自制七叶苷、七叶内酯的醇溶液。

(3)展开剂:甲醇-甲酸乙酯-甲苯(1+4:5)。

(4)显色:

① 紫外灯(254 nm)下观察,七叶苷为灰色荧光,七叶内酯为灰褐色荧光。

②以重氮化对硝基苯胺喷雾显色,七叶苷和七叶内酯均呈玛瑙色。

(5)结果:七叶苷R=0.04;七叶内酯R=0.28。

五、实验说明及注意事项

(1)记录七叶苷和七叶内酯的提取与分离过程。

(2)详细记录定性反应结果。

(3)绘制色谱图,并计算R; 值。

(4)总结实验过程中遇到的问题和解决方法。

六、思考题

索氏提取器提取药材的原理及其优缺点是什么?适用于哪些化学成分的提取?

项目四 黄酮类化学成分的提取、分离与鉴定

任务 槐米中芦丁的提取、分离与鉴定

【知识目标】

·了解槐米的来源及资源分布。

·熟悉芦丁、槲皮素等主要成分的结构类型、特点及植物分布。

·掌握芦丁、槲皮素等主要成分的理化性质。

【能力目标】

·依据芦丁、槲皮素的理化性质,运用煎煮法、碱溶酸沉法、沉淀法和重结晶法进行提取、分离纯化。

·根据苷的性质，学会苷的酸水解操作。·能够运用纸色谱、聚酰胺色谱和化学法鉴定芦丁,槲皮素。

一、槐米来源及主要化学成分性质

1.槐米来源

槐米为豆科植物槐(Sophora japonical.)的干燥花蕾,主产于黄土高原和华北平原等地区。

2.主要化学成分性质

槐米中含有芦丁,皮素,槐米甲素、槐米乙素、槐米丙素以及皂苷、鞣质、黏液质、树脂等化学成分。其中芦丁、槲皮素是主要有效成分。

(1)芦丁:又名芸香苷、维生素P。分子式为C,HO。·3H,O,淡黄色针状结晶,熔点为 174~178℃,无水物熔点为188~190℃。溶解度:在冷水中溶解比例为1:8000;在热水中溶解比例为1:200;在冷乙醇中溶解比例为1:300;在热乙醇中溶解比例为1:30;在冷吡啶中溶解比例为1:12,微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、氣仿、石油醚等溶剂,易溶于碱液,呈黄色,酸化后又析出,可溶于硫酸和盐酸,呈棕黄色,加水稀释又析出。

(2)槲皮素:又名栎精,分子式为C;HO,·2H0.黄色结品,熔点为313~314℃.无水物熔点为 316℃。溶解度:在冷乙醇中溶解比例为1:290;在沸乙醇中溶解比例为1:23,可溶于甲醇,乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂,不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。

二、实验原理

芦丁溶于热水,难溶于冷水,且分子中具有较多酚羟基,显弱酸性,在碱液中易溶,在酸液中易析出沉淀,故可采用煎煮法和碱提酸沉法提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差异,采用沸水为结晶溶剂进行精制,利用芦丁可被稀酸水解生成苷元和糖的性质,通过频仙反成.薄层色谱及纸色谱进行检识并确认芦丁和槲皮素。

三、实验材料

(一)实验试剂

槐米粗粉、沸水、0.4%砌砂水,灰乳,盐酸,2%硫酸、,饱和氢氧化钢溶液、10%a萘酚溶液、镁粉、1%乙酸镁甲醇溶液、1%三氣化铝乙醇溶液、2%二氣氧锆甲醇溶液、2%枸橼酸甲醇溶液等。

(二)实验仪器

设备烧杯、磁力搅拌器、加热套、圆底烧瓶、球形冷凝管、紫外灯、定性滤纸、纱布、试管、硅胶板、新华色谱滤纸(NO.2)聚酰胺薄膜等。

四、实验方法

(一)芦丁的提取

1.水提取法称取槐米 20g(压成粗粉),加沸水200mL,加热煮沸保持20min,上清液用四层纱布趁热过滤残渣同法再操作一次·合并两次滤液,充分静置.待全部析出后,减压抽滤,用蒸馏水洗涤,抽干.得粗制品·自然干燥,称量。

2.碱溶酸沉法

称取槐米 20g(压成粗粉),加人已煮沸的0.4%硼砂溶液200m,搅拌下加石灰乳调至pH为8-9,并保持该pH微沸20min,随时补充失去的水分,上清液用四层纱布过滤,残渣同样操作再提取一次,介并两次滤液,在60--70℃,川盐酸至pH为3~1.放置」冰箱中析品.待个部结品析出后诚压抽滤,用蒸馏水洗涤结品,抽丅,日然下,得料制品.称量

(二)芦丁的精制

取粗制芦丁2g.加蒸馏水 400 m1、点沸至芦丁全部济解·趁热立即抽滤,冷却后即可析出结晶,抽滤.得芦丁精制品。若结晶色泽呈灰绿色或暗黄色,表示杂质未除尽,可用甲醇或乙醇(参考溶解度加足踱逺产眚瑶側剂)回流加热溶解,并加人0.5%活性炭继续回流0.5h,抽滤除去炭渣,滤液放冷,待全部结晶析出后。抽滤结晶,自然干燥,得精制品,颜色呈浅黄色,称量。图13-11所示为精制芦丁的两种不同方法。

(三)芦丁的水解

取于燥精制芦丁1g,研细后置于 250 ml,圆底烧瓶中,加人 2%硫酸 80 mL.加热回流 30 min,瓶中浑浊液逐渐变为澄清的棕黄色液体,再生成鲜黄色沉淀。放冷沉淀,抽滤,保存滤液(应为澄清无色液体),用于糖的检査,沉淀物为芦丁苷元(槲皮素),用蒸馏水洗至中性,抽干水分,晾干,称量,得粗制槲皮素,再用乙醇重结晶得精制槲皮素。

取芦丁水解后的滤液20mL,加饱和氢氧化钡溶液中和至中性(搅拌下进行),滤去白色的硫酸钡沉淀,滤液浓缩至 2~3ml或蒸干后,加2~3ml乙醇溶解,作为糖的供试液(图13-12)。

(四)芦丁的鉴定

1.显色反应

取芦丁及槲皮素精制品约10mg.各用5ml乙醇溶解,制成样品溶液,按下列方法进行实验,比较苷元和苷的反应情况。

(1)Molish 反应:取样品溶液1ml,加10%a-萘酚溶液1mL,振摇后斜置试管,沿管壁滴加0.5mL硫酸,静置,观察并记录液面交界处颜色变化。

(2)盐酸-镁粉反应:芦丁与槲皮素溶液分别置于2支试管中,加入金属镁粉少许、盐酸2~3滴，观察并记录颜色变化。

(3)乙酸镁纸片反应:取两张滤纸条,分别滴加芦丁、皮素的乙醇溶液,然后各加1%乙酸镁甲醇溶液2滴,于紫外灯下观察荧光变化,记录现象。

(4)三氯化铝纸片反应:在两张滤纸条上分别滴加芦丁、皮素的乙醇溶液后,各加1%三氯化铝乙醇溶液2滴,于紫外灯下观察荧光变化,记录现象

(5)锆-枸橼酸反应:取样品溶液2mL,加2%二氯氧锆甲醇溶液3~4滴,观察颜色,然后加人2%枸橼酸甲醇溶液3~4滴,观察并记录颜色变化。

2.色谱鉴定

(1)芦丁和槲皮素的纸色谱。①色谱材料:新华色谱滤纸(NO.2)。②点样:提取的槲皮素及芦丁的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。③展开剂:正丁醇-乙酸-水(4:1:5)上层溶液。④展开方式:预饱和后,上行展开。⑤显色:喷洒三氯化铝试剂前、后,置日光及紫外灯(365nm)下检视色斑的变化。观察记录:记录图谱及斑点颜色。

(2)芦丁与槲皮素的聚酰胺色谱。①色谱材料:聚酰胺薄膜。②点样:提取的芦丁与槲皮素的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。③展开剂:水饱和的正丁醇-乙酸(10:0.2)④展开方式:上行展开。

憔视显色:喷洒三氯化铝试剂前、后,置日光及紫外灯(365nm)下检视色斑的变化。⑥观察记录:记录图谱及斑色颜色。

(3)糖的色谱鉴定

①色谱材料:新华色谱滤纸(NO.2)。②点样:糖的供试液及葡萄糖、鼠李糖对照品溶液。③展开剂:正丁醇-乙酸-水(4:1:5)上层溶液。④展开方式:上行展开。⑤显色:氨性硝酸银试液,喷酒后先用电吹风冷吹至干,再吹热风至出现斑点为止⑥观察记录:记录图谱及斑点颜色。

五、实验说明及注意事项

(1)槐米压成粗粉便于有效成分溶出,但也不宜过细;直接采用沸水提取,是为了破坏酶的活性,提高收率。

(2)提取液加0.4%硼砂溶液的目的是与芦丁邻二羟基络合,保护酚羟基不被氧化,同时避免石灰乳中钙离子与芦丁生成难溶于水的络合物,降低收率。

(3)在保持微沸过程中时刻注意补充损失的水分及用石灰乳调节pH至8~9。

六、思考题

(1)碱溶酸沉法中使用石灰乳的目的是什么?

(2)选择水或乙醇作为重结晶溶剂的依据是什么?

项目五 挥发油类化学成分的提取、分离与鉴定

任务 八角茴香油的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】

·了解八角茴香的来源及总挥发油含量。

·熟悉八角茴香中所含的主要挥发油成分的理化性质。

·掌握单向二次展开薄层色谱法。

【能力目标】

·能采用水蒸气蒸馏法提取挥发油。

·能够应用油斑实验对挥发油进行鉴定。

·能够运用单向二次展开薄层色谱对挥发油进行简单分离和显色鉴定。

一、八角茴香的来源及主要挥发油成分

1.八角茴香的来源

八角茴香为木兰科植物八角茴香(Illicium verum Hook.f.)的干燥成熟果实,挥发油含量约5%

2.主要挥发油成分

八角茴香中含有多种挥发油成分,主要是茴香脑,占八角茴香总挥发油的80%~90%。茴香脑为白色结晶,熔点为 21.4℃,溶于苯、石油醚、乙酸乙酯,二硫化碳及丙酮,几乎不溶于水。除茴香脑外,八角茴香中还有少量茴香醛、茴香酸、甲基胡椒酚等成分。

二、实验原理

挥发油具有挥发性,可用水蒸气蒸馏法进行提取,实验时可使用一般的水蒸气蒸馏装置或挥发油含量测定器提取挥发油。挥发油常包含烷烃、烯烃、醇、酚、、酮或酸,大致可分为不含氧的萜烃类挥发油和含氧的挥发油两大类,前者极性较小,后者极性较大,为使两类挥发油成分在薄层板上较好地分离,可采用单向二次展开薄层色谱法。

三、实验材料

(一)实验试剂

八角茴香粗粉、蒸馏水等。

(二)实验仪器设备

圆底烧瓶(1000 mL),电热套、挥发油提取器、球形冷凝管、具塞锥形瓶、纱布、定性滤纸、硅胶板、冰箱等。

四、实验方法

(一)提取与分离

称取八角茴香50g.捣碎,置于轻型挥发油含量测定器烧瓶中,加10倍量蒸馏水,连接挥发油测定器,自测定器上端加水使其充满刻度部分,并至溢流入烧瓶时为止,连接回流冷凝管。缓缓加热至沸提取.直至测定器中油量不再增加,停止加热,放冷,分取油层,即八角茴香总挥发油,计算收率。紉朦绗的将玨灵僅硭炝洗榟焑堤逨筅壴狄戧盎徨兴魆著跶刷茴香总挥发油留出少量做薄层鉴定,其余置冰箱冷却约1h.可见白色结晶析出.低温过滤,得到茴香脑结晶,滤液部分则为脱除茴香脑之后的八角茴香挥发油。上述得到的三部分产品均留样备用,以供鉴定。

(二)鉴定

1.油斑实验

取八角苘香油,滴于滤纸片上,室温下观察油斑是否慢慢消失,还可并行做脂肪油实验。

2.单向二次展开薄层色谱

取制好的硅胶板一块,在距底边1.5cm、板长1/2处、5/6处分别用铅笔画起始线、中线及前沿。将三种样品点在起始线上,先在石油醚-乙酸乙酯(85:15)展开剂中展开至薄板中线时取出,挥去展开剂,再以石油醚展开至前沿时取出,挥去展开剂,用香草醛-浓硫酸显色,于105℃加热数分钟后,观察斑点的数量、位置及颜色,并推测挥发油中可能含有的化学成分的数量。

五、实验说明及注意事项

(1)收集水蒸气蒸馏液时,要观察挥发油提取的刻度,待刻度不再改变时再收集,并使用稍小一些的锥形瓶,以免造成浪费。

(2)采用电热套加热时,圆底烧瓶的外壁应保持干燥状态,防止水滴落人电热套中.造成短路

(3)加热后的圆底烧瓶温度较高,切忌直接用手触碰,以免烫伤。

六、思考题

(1)水蒸气蒸馏提取的原理是什么?与普通蒸馏相比的优点是什么?

(2)如何判断提取终点?

项目六、多糖类化学成分的提取、分离与鉴定项

任务 黄芪中多糖的提取、分离与鉴定

学习目标

【知识目标】

·了解黄芪多糖的来源。

·掌握黄芪多糖的理化性质。

·掌握黄芪多糖的鉴别方法。

【能力目标】

·依据黄芪多糖的性质,采用合适的方法进行黄芪多糖的提取、分离和鉴定。

·能够运用醇沉法和灼烧法鉴别黄芪多糖。

一、概述

黄芪为豆科植物的干燥根,主要药理成分是黄芪多糖和黄芪苷。黄芪多糖在医药和畜医临床上应用较为广泛,可作为免疫促进剂和调节剂,同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗应激,抗氧化等作用。

二、实验原理

黄芪多糖是极性大分子化合物,作为黄芪纤维质的组成部分,其提取收率取决于黄芪纤维质的溶胀作用和溶解性,而纤维质在碱中的溶胀作用和溶解性相比水中均显著增加。同时在碱性条件下经维质之间的酯键易断裂而发生剥皮反应,使更多的多糖得以游离而被提取出来,从而提高多糖收率因此黄芪多糖多采用不同温度的水和弱碱溶液进行提取,尽量避免在酸性条件下提取。方法是采用pH 9~10 的 CaO)或 Na2CO3溶液煮沸提取,浓缩时调pH至6.5左右,加入一定浓度的乙醇离心分离,加水溶解后过滤,滤液中加乙醇沉淀,丙酮洗涤,冷冻或真空干燥,获得粗多糖

三、实验材料

(一)实验试剂

黄芪粗粉、CaO) 溶液、盐酸、95%乙醇、丙酮等。(二)实验仪器设备圆底烧瓶、电热套、球形冷凝管、旋转蒸发仪、托盘天平,粉碎机、电磁炉,白瓷缸、纱布、烧杯、玻璃棒,冷冻干燥机、离心机、Bio-gel P60 凝胶柱层析、坩埚等。

四、实验方法

(一)黄芪多糖的提取黄芪多緔律糖的提取用CaO溶液提取法。采用pH9~10CaO溶液,煮沸提取,浓缩时调pH 至6.5左右。

(1)称取黄芪根(500g)100g,去掉杂质和泥土,粉碎成粉末。

(2)黄芪根加人6~7倍的CaO溶液,煮沸1h,用8层纱布过滤。

(3)合并滤液调pH至6.5左右。

(4)将浓缩液加人2倍量的95%乙醇沉淀。

(5)倾去上清液,沉淀物再加人95%乙醇,至浓缩为80%,静置倾出上清液。(葟塖顾如靓滤渣用丙酮洗涤2次,过滤。将滤渣放人干燥器中,-20℃冷冻真空干燥,即得到黄芪多糖。

(二）黄氏多糖的分离

1.分级醇沉

取100g黄芪多糖总提取物加水溶解,配制成质量浓度为40%的黄芪多糖溶液。以8000r/mir离心取上清液,在上清液中加乙醇调至醇浓度为10%,收集沉淀,将上清液调节至醇浓度为20%.再次收集沉淀,将上清液调节至醇浓度为30%,依此类推,直至醇浓度为90%。将各浓度下的醇沉物放转蒸发后减压干燥,计算多糖的收率。

2.Bio-gel P60 凝胶柱色谱

将分级醇沉得到的样品分别配制成质量浓度为8%的多糖溶液,Bio-gelP60凝胶柱色谱(1.5cmX100cm)流速为20mL/h。紫外线(206nm)结合硫酸/a-萘酚法检测糖峰。收集糖峰,用旋转蒸发仪浓缩至多糖黏附于侧壁,置减压干燥箱内减压干燥过夜,获得黄芪多糖各组分。

(三)黄芪多糖的鉴定

1.性状鉴定

(1)外观鉴别:优质黄芪多糖呈类白色或淡黄色,粉末细腻、均匀无杂质。

(2)溶解性鉴别:优质黄芪多糖溶解性好,溶解后无杂质,但溶解速度过快时,则可能混有杂质。劣质黄芪多糖溶解性差,溶后有大量杂质。

2.化学鉴定

(1)醇沉法:根据相似相溶原理,自然界中蛋白质、果胶、淀粉及多糖等物质不溶或微溶于乙醇,故采用此法鉴别黄芪多糖的真伪。一般而言,50%的乙醇能使蛋白质、淀粉、果胶等物质呈黏稠状,产生黄色沉淀;80%以上的乙醇可以醇沉出具有活性的黄芪多糖,呈乳白色絮状沉淀。因此,真正的黄芪多糖产品加人 80%的乙醇后产生白色架状物,静置后产生粉末状沉淀;而伪劣产品无白色絮状物产生,静置后产生较大的颗粒性沉淀。

(2)灼烧法:真正的黄芪多糖放在锡箔纸上或坩埚中,用350℃高温加热会出现冒泡状沸腾,呈蜂窝状结块。

五、实验说明及注意事项

(1)提取的黄芪多糖为灰白色粉末,易溶于水,溶液呈乳白色,无杂质。最后得到的黄芪多糖在乙醇中形似豆腐花,灰白色。

(2)黄芪多糖为黄芪纤维质的组成部分。纤维质在水中的溶胀作用和溶解性差,因此水提取法收率低。而其在碱性溶液中的溶胀作用和溶解性显著增强。纤维质之间的酯键易断裂而发生剥皮反应,使更多的多糖得以游离而被提取出来,从而提高多糖的收率。因此黄芪多糖应尽量避免在酸性条件下提取。

六、思考题

黄芪多糖的提取方法还有哪些?试通过查阅文献资料简要回答2~3种。