植食性昆虫对肠道细菌的依赖程度，以及这些微生物帮助昆虫克服宿主植物化学防御的分子机制，目前仍存在争议。近日，浙江农林大学张守科副教授和中国林业科学研究院亚热带林业研究所舒金平研究员在国际著名期刊Microbiome上合作发表了题为“Gut bacterium Acinetobacter sp. assists Camellia weevil with host plant adaptation by degrading tea saponin via the benzoate pathway”的研究论文。本研究旨在探究茶籽象甲的肠道共生菌——Acinetobacter sp. AS23，如何提升茶籽象甲对宿主植物中有毒茶皂素的耐受性。

百谱生物为该研究提供了非靶代谢组检测服务！

期刊名称：Microbiome

影响因子：12.7

发表时间：*开通会员可解锁*

研究方法：转录组+非靶代谢组

研究思路：

研究方法

毒性试验：评估AS23菌株茶皂素降解产物对茶籽象幼虫的毒性；

代谢组学分析：使用液相色谱-质谱联用技术进行非靶向代谢分析，确定降解产物；

转录组学分析：通过Illumina MiSeq平台进行RNA测序，结合Bowtie2、DESeq2等工具分析差异表达基因；

KEGG通路富集分析：KEGG数据库分析代谢通路；

qRT-PCR：验证苯甲酸降解途径中关键基因的表达水平；

CRISPR-Cas9基因编辑：构建AS23菌株基因敲除突变体，验证关键酶基因功能；

高效液相色谱（HPLC）：定量分析苯甲酸降解产物的浓度；

统计分析：使用R Studio（ggplot2、enrichplot、clusterProfiler）、GraphPad和SPSS进行数据分析和可视化。

研究结果

不动杆菌AS23菌株与茶皂素共培养产生的代谢物对油茶象甲幼虫具有不同毒性

毒性实验表明，当三龄油茶象甲幼虫（CW）被喂食含茶皂素降解24小时、48小时和72小时（不含 AS23 菌株）发酵滤液的人工饲料时，其存活率存在显著差异（P<0.05）（图1B）。

茶皂素降解24小时的发酵滤液毒性最高，导致油茶象甲幼虫死亡率达85%（图1C）。降解48小时后，发酵滤液的毒性显著降低，前25天内幼虫存活率维持在60%，与对照组相比无显著差异（P>0.05）（图1D）。类似地，降解72小时后，幼虫存活率与48小时时相近，约为65%，与对照组相比也无显著差异（P>0.05）（图1E）。

图1 不同降解时间的茶皂素对无菌油茶象甲三龄幼虫的毒性评估

时间转录组分析揭示了苯甲酸代谢途径在茶皂素降解中的作用

作者对AS23菌株在茶皂苷降解过程中0小时、24小时、48小时和72小时的样本进行了转录组测序。通过分析各组样本间的基因表达相关性发现，24小时和48小时处理组之间的相关性显著强于72小时组，相关系数接近1。对照组（CK）与其他所有处理组均存在显著差异（图2A）。总体而言，处理组与对照组之间的差异表达基因（DEGs）数量显著高于处理组之间的差异（图2B）。在比较三个处理组（24小时、48小时和72小时）与对照组时，无论是DEGs总数还是上调/下调基因数量，均未观察到显著差异（图2B）。

差异表达基因（DEGs）在对照组（CK）与处理组之间存在显著共性：24小时和48小时处理组各有24个独特差异基因，72小时处理组则有34个独特差异基因（图2D）。其中表达量最高的10个差异基因全部属于处理组与CK组的共有基因（图2C）。为深入解析茶皂素处理对AS23菌株的影响，作者采用KEGG通路富集分析。结果显示，这些差异基因主要分布在代谢、细胞过程、环境信息处理和遗传信息处理四大功能类别。在前20个富集通路中，代谢相关通路占比最高（13个通路），而遗传信息处理通路占比最低（1个通路）。其中，Ko02010（ABC转运蛋白）通路以47个差异基因位居首位，Ko00362（苯甲酸降解）通路则显示出最显著的富集效应（图2E）。

图2 不动杆菌AS23降解茶皂苷的转录组分析

时间代谢组学分析显示，茶叶皂苷降解过程中苯甲酸化合物呈现显著富集现象

为探究AS23菌株的茶皂苷降解能力，作者采用非靶向液相色谱-质谱联用技术进行代谢组学分析。主坐标分析（PCoA）显示，对照组与AS23处理组存在显著差异。在三个处理组中，24小时和48小时组的样本聚类紧密，但与72小时组样本明显分离，且样本间差异微小。

总体而言，AS23处理形成了三个明确的聚类：对照组、24小时组、48小时组和72小时组，这与转录组测序的聚类结果一致（图3A）。24小时、48小时和72小时组之间的差异表达代谢物（DEMs）数量相对较少（图3B（1、2、4））。

相比之下，各处理组与对照组的对比显示，处理组的代谢相关差异显著增多（图3B（3、5、6））。通过KEGG富集分析，确定了各组间代谢相关差异的前20条富集代谢通路。在所有三组对比中，“芳香族化合物降解”通路均呈现显著富集特征。尽管茶皂苷作为三萜糖苷类化合物，其主链结构通常不含苯环，但芳香族化合物的广泛降解可能与茶皂苷降解过程中的特定步骤密切相关。

作者还发现另一条关键代谢通路——苯甲酸降解。苯甲酸是皂苷降解过程中的中间代谢产物。其前体苯甲酸和最终产物苯酚均为有毒化合物，不应在生物体内长期蓄积。值得注意的是，苯甲酸降解通路（Ko00362）在转录组测序的差异基因表达分析中也显示出显著富集（图3C）。

图3 不动杆菌AS23对茶皂苷降解的代谢组学分析

苯甲酸代谢途径是茶叶皂苷的核心降解途径

对苯甲酸降解途径的转录组分析发现，差异表达基因呈现三种典型表达模式：基因2442至2444表达量下降，基因1547至2266在初始处理阶段表达量上升，而基因1580至1700在处理72小时后表达量显著增加。其中，基因1547至2266在初始阶段的24小时和48小时表达量均呈现上升趋势，另有10个基因（基因1580至1700）则遵循其他两种表达模式（图4A）。代谢组学数据同样揭示了苯甲酸降解相关代谢物的三种丰度变化模式：(1)初始处理阶段（包括焦没食子酸和3,4-二羟基苯甲酸）丰度显著增加，(2)处理72小时后（包括对水杨酸和龙胆酸）丰度明显上升，(3)整个处理期间（包括4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸和苯酚）丰度持续偏低（图4B）。

为阐明富集基因与化合物间的复杂调控关系，作者构建了相关性网络。焦儿茶酚与差异表达基因（DEGs）的关联度最高，其余六个差异代谢物也显示出显著的基因关联（图4C）。在差异表达基因中，基因2441与六个代谢物呈负相关，而基因2532则与六个代谢物呈正相关，相关数量最多。差异表达基因2530、1547、1542、1546和2529各自与五个代谢物呈正相关，而基因2442则呈现四个负相关。这些核心基因和代谢物共同构成了苯甲酸降解途径的关键组分（图4C）。

图4 差异表达基因表达丰度热图及相关网络分析

苯甲酸代谢途径中的四种关键酶参与苯甲酸水解

通过整合转录组与代谢组分析，并结合差异表达基因（DEGs）与差异表达代谢物（DEMs）的相关性分析，绘制了苯甲酸代谢核心通路的示意图（图5）。该通路包含五个关键代谢物和四个酶基因，qPCR结果证实茶皂素处理后这些基因的表达量显著增加。

为验证通过组学筛选鉴定的关键基因功能，作者采用双质粒基因编辑系统构建了AS23菌株的基因敲除株。实验结果显示，单敲除K16243、K05549和K05783基因的菌株仍能利用茶皂苷并在茶皂苷筛选培养基中生长。然而，双敲除突变体K16243+K05549和K16243+K05783完全丧失了利用茶皂苷的能力（图5E）。为验证这些双敲除突变体是否仍能降解苯甲酸（C00180），作者将其置于含C00180的液体培养基中培养24小时，随后检测了C00180的含量（图5F）。实验数据显示，双敲除突变体的C00180含量显著高于对照菌株，表明其降解能力大幅下降（图5F）。研究证实，K16243与K05549、K16243与K05783这三组基因组合，分别在茶皂苷的两条降解途径中发挥关键作用，且具有功能冗余性。

图5 苯甲酸降解途径在茶叶皂苷降解中的作用

以Acinetobacter sp.AS23突变株滤液为食的山茶花象鼻虫丧失了耐受茶皂素毒性的能力

统计分析显示，当喂食含有K16243+K05549或K16243+K05783双敲除突变株C00180的发酵滤液时，CW幼虫存活率约为10%（图6A-D），而人工饲料组存活率则维持在约70%（图6A-D）。重新引入野生型AS23菌株后，CW幼虫恢复了对苯甲酸毒性的耐受能力（图6E-H）。与K16243+K05549和K16243+K05783双敲除突变株互补菌株相关的CW幼虫死亡率高达100%（图6E-H）。

图6 茶皂素及其降解产物暴露下，不动杆菌AS23突变株与野生型菌株对茶树象甲幼虫存活率的影响

研究总结

毒性实验表明，AS23菌株对茶皂素的降解能力具有时间依赖性。在茶皂素降解过程中，苯甲酸降解通路是富集的核心代谢通路；通过实时荧光定量PCR及功能研究，证实该通路涉及4个关键酶基因。将基因敲除菌株重新引入茶籽象甲肠道后，其解毒能力显著下降，幼虫死亡率显著升高。本研究阐明了AS23菌株通过苯甲酸降解通路，在介导茶籽象甲幼虫耐受茶皂素过程中发挥的关键作用。该研究强调了利用微生物皂素降解通路开发环境友好型害虫防治策略的潜力。

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